Mushroom Musume начинается, когда Отшельник получает от Лесной Ведьмы спору в горшке. Игроку предстоит взять на себя родительские обязанности Отшельника и направлять взросление грибного отпрыска посредством череды выборов. Действия и решения геймера напрямую определяют жизненный путь дочери, который приводит к одной из многочисленных концовок. Проект выполнен в формате интерактивной новеллы, где поступки формируют разворачивающиеся события и знания о мире. Такая структура позволяет менять ракурс повествования, в том числе давая возможность взглянуть на окружение глазами других персонажей.

Каждая история подходит к своему финалу, что побуждает начинать весь процесс заново с новой спорой. Мир Mushroom Musume содержит события и сведения, которые открываются только после нескольких прохождений за разных героинь. Решения на этапе воспитания могут привести к формированию конкретного вида, например, Мухомора, или к более хищническому существованию в роли Кордицепса. Эта цикличная игра является основой для изучения всего повествования и его разветвленных путей, что создает более целостную картину местного мира.

Завершение жизненного цикла воспитанницы вознаграждается Спорами. Этот ресурс используется между поколениями для открытия перманентных приспособлений и улучшений, которые облегчают последующие попытки родительства. Можно разбить личный сад, который предоставляет постоянные бонусы для будущих протеже, или же воспользоваться кругом призыва для получения артефактов. Внутренний игровой Грибной Альманах также служит сборником, где каталогизируются воспоминания о прошлых воспитанницах и другие найденные элементы, доступные для просмотра.